Il percorso museale si articola in circa venti sale disposte su quattro livelli, in una movimentata e insolita successione di ambienti che si conclude in una loggia vetrata con vista dall'alto sul borgo di Anghiari.
Caratteristica peculiare dell'esposizione è proprio quella di affiancare alle opere maggiori un’ampia raccolta di oggetti legati alla vita e alle tradizioni popolari della zona, d’uso domestico e agricolo.
Attraverso frammenti scultorei e affreschi staccati, al piano terreno si documentano alcuni aspetti della storia della Valtiberina. Il piano nobile è dedicato alla scultura lignea e alle robbiane e conserva il capolavoro del Museo, la Madonna con Bambino di Jacopo della Quercia (1420).
Degno di nota è l’organo positivo da tavolo della prima metà del Cinquecento, unico nel suo genere e ancora funzionante.
Il terzo piano espone una collezione di armi anghiaresi, famose per la ricchezza delle decorazioni, e dipinti del Cinquecento e Seicento (Giovanni Antonio Sogliani, Matteo Rosselli, Jacopo Vignali, Giovan Battista Ghidoni).
Singolare la raccolta di Madonnine agghindate che, unite alla collezione di don Nilo Conti, ricca di ex voto e carte gloria, ricostruisce alcuni aspetti della devozione popolare.
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